人類對(duì)腸道發(fā)育的認(rèn)知還不夠完善，如果將單細(xì)胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合起來，人們就可以兼顧單細(xì)胞的分辨率與空間位置的準(zhǔn)確性，從而描述腸道發(fā)育隨時(shí)間變化的形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)共確定了 101 種細(xì)胞形態(tài)，包括上皮和間充質(zhì)細(xì)胞群和關(guān)鍵形態(tài)改變之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)人員描述了隱窩絨毛軸是如何形成的，以及神經(jīng)、血管、間充質(zhì)形態(tài)發(fā)生和發(fā)育中的腸道免疫群體。同時(shí)，研究人員還鑒定了發(fā)育中的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞亞型的分化層次，并描述了這些亞型的不同功能。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了派伊爾結(jié)和腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）的起源，并描述了位置特異性免疫程序。利用實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論，他們提出了一個(gè)形態(tài)形成梯度的無偏性分析，直接關(guān)聯(lián)連續(xù)的幾波細(xì)胞分化，并確定了細(xì)胞及位置與罕見的發(fā)育性腸道疾病有關(guān)。

科學(xué)問題

腸道有著怎樣的發(fā)育過程？

腸發(fā)育過程的紊亂又怎樣與疾病相關(guān)？

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

從 17 個(gè)胚胎中不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)與組織位置取出的共 77 個(gè)腸道樣本，總計(jì) 76592 個(gè)細(xì)胞。

技術(shù)：10X genomics

實(shí)驗(yàn)思路

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 1   人類腸道發(fā)育的時(shí)空轉(zhuǎn)錄圖譜

圖 2   胎兒腸道發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和受體 - 配體相互作用

1、根據(jù)發(fā)育時(shí)間和空間對(duì) 101 種腸細(xì)胞的分類

作者從代表不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)和組織位置的 17 個(gè)胚胎收集的 77 個(gè)腸道樣本中 10x Genomics 的單細(xì)胞基因表達(dá)解決方案生成了 scRNA 序列圖譜（圖 1），經(jīng)過聚類，分為 9 種腸道組成細(xì)胞（圖 1C，D），并展示了它們?cè)诳臻g位置與發(fā)育時(shí)間的差異（圖 1E,F）。通過進(jìn)一步的細(xì)分，基于標(biāo)志基因劃分出共 101 個(gè)細(xì)胞亞群（圖 1G）。接下來研究人員又基于 464 種目前已知的發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子針對(duì)細(xì)胞命運(yùn)繪制了“決定樹”（圖 2A），并對(duì) 101 個(gè)亞群的細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞通訊分析（圖 2C），辨認(rèn)假定的受體 - 配體對(duì)。

 2、單細(xì)胞的空間位置

為了繪制 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的空間分布圖，作者利用 10x Genomics 的 Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)來自整個(gè)腸道發(fā)育的組織進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，在每張切片中確定了映射到離散位置的 5 -13 個(gè)點(diǎn)簇，以上述 scRNA-seq 圖譜為參考，作者通過因子分析以確定每個(gè)聚點(diǎn)可能的單細(xì)胞組成，從而在空間上定位所有 scRNA-seq 簇（圖 3A）。這種定位能夠很好地描述細(xì)胞類型，例如在隱窩底部的上皮干細(xì)胞（ISCs）（圖 3Ai 與 3Aii），位于平滑肌外層的 FOXF2- 肌層細(xì)胞（圖 3Aiii），以及處于隱窩頂部的 BEST4/OTOP2 細(xì)胞（圖 3Aiv）。圖 3B 展示了隱窩頂部腸細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞合適的解剖學(xué)定位，RET 在肌腸叢特異表達(dá)，PTPRC (CD45) 在粘膜下淋巴濾泡特異表達(dá)。

圖 3  ST 和 scRNA-seq 整合的腸道發(fā)育時(shí)空分析

3、人類腸上皮細(xì)胞與 ISCs 的發(fā)育

根據(jù)細(xì)胞的吸收性、分泌性、未分化與干細(xì)胞基因特征可以很輕易地對(duì) 17622 個(gè)被捕獲的上皮細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分（圖 4A）。分析結(jié)果表明近端（小腸 [SI]) 和遠(yuǎn)端（結(jié)腸）樣本之間有著顯著位置差異，這一差異由高特異性基因表達(dá)（如 CCL25 和 APOE) 劃分（圖 4A 和 4B)。這表明，在隱窩形成之前，特定位置的轉(zhuǎn)錄程序已經(jīng)在發(fā)育中建立起來。隨著時(shí)間的推移，可以觀察到上皮細(xì)胞的大量細(xì)胞重塑，在 12 PCW（post-conceptual weeks）之前，祖細(xì)胞 /TA 細(xì)胞占主要組成部分，很少看到成熟的吸收和分泌細(xì)胞，而在 12PCW 之后，上皮組織的組成已經(jīng)與成人組織相似（圖 4C）。在對(duì) ISCs 發(fā)育的研究過程中，實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)了一群近端上皮干細(xì)胞樣祖細(xì)胞，進(jìn)而會(huì)形成早期腸細(xì)胞。這些細(xì)胞表現(xiàn)出許多原始特征，包括在中胚層分化中重要的 VTN 高表達(dá)，與 ISCs 相比，LGR5 表達(dá)很少，ONECUT2 表達(dá)參與上皮發(fā)育（圖 4B）。在小腸中，這些細(xì)胞獨(dú)特地表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 GATA4（圖 4E），在 12 周之后，這一表達(dá)又大部分丟失。這些細(xì)胞高度表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白（圖 4B,F），證實(shí)了在絨毛形成過程中鐵代謝的重要性。LGR5 是 ISC 的特征基因，在妊娠早期（<12PCW）被檢測出在近端 / 遠(yuǎn)端 ISCs 及干細(xì)胞樣祖細(xì)胞中廣泛的低表達(dá)，即使在隱窩形態(tài)建立后（例如，19 個(gè) PCW 后），ISCs 在遠(yuǎn)端 / 近端樣本中分別占捕獲的上皮細(xì)胞的平均比例為 18%-22%，高于成人結(jié)腸 scRNA-seq 研究中捕獲的 3%-4%。由此實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)了隨發(fā)育進(jìn)行的 ASCL2 轉(zhuǎn)錄因子模塊的顯著表達(dá)上升（包含下游調(diào)控目標(biāo) LGR5）。

圖 4   子宮上皮成熟和隱窩發(fā)育

4、腸道血管生成，神經(jīng)系統(tǒng)和肌層固有層發(fā)生，腸固有層間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)育

如圖 5A 所示上皮細(xì)胞被劃分為靜脈型，動(dòng)脈型和淋巴型細(xì)胞，根據(jù)血管的尺寸，它們又被進(jìn)一步細(xì)分。隨著發(fā)育時(shí)間進(jìn)程可以觀察到小血管內(nèi)皮細(xì)胞向大血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，反映了腸道血管發(fā)生，驅(qū)動(dòng)這一過程的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)已得到辨認(rèn)，如動(dòng)靜脈分化因子 HEY1 和 SOX13。作為內(nèi)皮細(xì)胞的補(bǔ)充，周細(xì)胞亞型由血管生成驅(qū)動(dòng)因子（PRRX1, THBS4, and ANGPT2) 定義（圖 5B）。實(shí)驗(yàn)人員在腸道發(fā)育的早期階段發(fā)現(xiàn)了不同的神經(jīng)元和膠質(zhì)祖細(xì)胞，共捕獲到了 5 種膠質(zhì)細(xì)胞和 7 類神經(jīng)細(xì)胞（圖 5E）。在成年人的腸道內(nèi)，神經(jīng)叢被肌肉包圍，圖 5F 中祖細(xì)胞和分化的腸平滑肌細(xì)胞（iSMCs) 分別用 PLPP2 和 ACTA2 基因區(qū)分。他們?cè)谀c道發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：KLF7 存在于肌細(xì)胞中，TWIST2 存在于間質(zhì)和外層肌細(xì)胞中，F(xiàn)OXF2（該基因缺失突變會(huì)致死）特異性活化于內(nèi)層肌細(xì)胞中。這一發(fā)現(xiàn)與平滑肌介導(dǎo)的機(jī)械力啟動(dòng)絨毛形成的可能性相一致。受測細(xì)胞中大的類群為間充質(zhì)細(xì)胞，它能夠支持上述的其它細(xì)胞組分。基于先前的研究結(jié)果這些細(xì)胞可被劃分成 s1-s4 四個(gè)類別，再輔以時(shí)間、空間、分化周期信息，這些細(xì)胞進(jìn)一步被劃分為 16 個(gè)類群（圖 5G）。圖 5H 展示了對(duì) s3 細(xì)胞類群的空間定位，并對(duì)幾種 s3 類群的差異基因表達(dá)進(jìn)行了定位，如 C7（圖 5Hii）。將胎兒細(xì)胞類型標(biāo)志基因?qū)?yīng)到成人空間轉(zhuǎn)錄組切片上，實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn) S3 HAND1+ 和 S3 EBF+ 細(xì)胞聚集在大血管周圍（圖 5Hiii-Hiv），概括了成年人的 S3 類群。這突出了這些細(xì)胞可能的作用，形成一個(gè)支持腸道血管的生態(tài)位。細(xì)胞通訊分析證實(shí)了這一點(diǎn)，ECs、周細(xì)胞和“S3”型成纖維細(xì)胞信號(hào)在同一空間位點(diǎn)相關(guān)（圖 3Ci）。

圖 5   間充質(zhì)和內(nèi)皮間室細(xì)胞的協(xié)調(diào)發(fā)展

5、腸道發(fā)育過程中無偏差形成素梯度作圖

圖 6A 中展示了形成素分子的互作關(guān)系，虛線標(biāo)注了富集的信號(hào)通路。基因共表達(dá)分析辨認(rèn)出 11 種特異細(xì)胞類型和 13 種空間共定位形成素模塊?？臻g模塊 3 由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞來源的形成素分子組成，包括 LRP1，位于組織深部（圖 6Bi）。RSPO3 可以通過 LGR5 向 ISCs 發(fā)出信號(hào)，它在間皮 / 肌層模塊中較高，在 PCW 12 之前主要可見，然后隨著組織深度的增加而消失（圖 6C）。這說明發(fā)育過程存在這樣一種模式：隨著發(fā)育中的腸道的生長，形成素分子的梯度可能會(huì)因?qū)娱g物理距離的增加而被打破，但可以通過順序發(fā)育的細(xì)胞類型的表達(dá)來恢復(fù)。

6、S2 成纖維細(xì)胞具有空間位置特異性并控制上皮模式

實(shí)驗(yàn)人員在發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)不同的 S2 簇，它們表達(dá) TGF-β (BMP2, BMP4 和 BMP5) 和非標(biāo)準(zhǔn) WNT 通路（WNT5A 和 WNT5B) 的關(guān)鍵形成素分子。這些 s2 特異性基因構(gòu)成了主要的黏膜下成纖維細(xì)胞形成素模塊的一部分，該模塊包含 DLL1、BMP5 和 NRG1（圖 6D）。再加上 RL 相互作用，如 DLL1-NOTCH2，突出了 S2 細(xì)胞及其在上皮形成中提供的豐富形態(tài)形成生態(tài)位的重要性。末端回腸（TI）和結(jié)腸 S2 細(xì)胞有著 885 個(gè)差異表達(dá)的基因。在 10 PCW 之前這些細(xì)胞展現(xiàn)出許多位點(diǎn)特異性差異，代表了在隱窩 / 絨毛形成之前很強(qiáng)的位置一致性，例如，POSTN 和 BMP3 在它們各自的 S2 亞型中很早就出現(xiàn)了（圖 6E）。S2 形態(tài)形成譜中這種關(guān)鍵的位置差異指明了一種機(jī)制，通過這種機(jī)制，可以形成不同的上皮形態(tài)。

圖 6 在特定的細(xì)胞類型和空間位置中的腸道形態(tài)發(fā)生素梯度

7、人類腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育

實(shí)驗(yàn)中一共捕獲到了 6 種共計(jì) 2199 個(gè)免疫細(xì)胞（圖 7A，7B）。在 10 PCW 之前，髓系免疫細(xì)胞更為豐富，而在第 12PCW 之后會(huì)出現(xiàn)幼稚 CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK)、1 型先天淋巴細(xì)胞（ILCs) 和 3 型 ILCs（圖 7C）。CCL19, CCL21, 與 CXCL13 是和派伊爾結(jié)形成有關(guān)的基因，并表達(dá)于基質(zhì)組織細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些細(xì)胞特異性地定位在兩個(gè) S4 成纖維細(xì)胞簇中，并且隨著發(fā)育表達(dá)增加。通過將黏膜下淋巴濾泡作為獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，研究其空間轉(zhuǎn)錄組切片，研究人員在這些濾泡內(nèi)及周圍找到了成人免疫細(xì)胞以及 S4 類型細(xì)胞（7F），同時(shí)也在其中找到了受體 - 配體對(duì)，包括 CCR7/CC19。因此認(rèn)定 S4 細(xì)胞是成人結(jié)腸中免疫濾泡鄰近的成纖維細(xì)胞，在胎兒 GALT 發(fā)育過程中以時(shí)間依賴性的方式出現(xiàn)。考慮到 S4 CXCL13+ 亞型成纖維細(xì)胞的缺失會(huì)損害派伊爾結(jié)的形成，綜上認(rèn)定派伊爾結(jié)中隱窩周圍成纖維細(xì)胞為上皮隱窩生態(tài)位支持細(xì)胞、淋巴組織形成的協(xié)調(diào)者和基質(zhì) - 免疫交互的介質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了它們迄今為止未被認(rèn)識(shí)到的高度動(dòng)態(tài)的作用。

圖 7   早期腸道免疫定植和免疫基質(zhì)相互作用

8、繪制先天性腸道疾病的細(xì)胞基礎(chǔ)圖

為揭露嚴(yán)格遵循時(shí)間順序的致病轉(zhuǎn)錄缺陷，實(shí)驗(yàn)人員整合了健康人類與患病者的數(shù)據(jù)。通過整合 749 個(gè)已知的疾病基因和本次實(shí)驗(yàn)的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，他們將先天性疾病與可能通過高度細(xì)胞類型特異性缺陷表現(xiàn)出來并導(dǎo)致腸道、腹側(cè)、會(huì)陰、神經(jīng)節(jié)、炎癥或腫瘤病理的紊亂的表型聯(lián)系起來（圖 8A,B）。SOX10 和 RET 與巨結(jié)腸病相關(guān)，在腸神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)（圖 8Cii），包括淋巴相關(guān)膠質(zhì)細(xì)胞?？紤]到這些細(xì)胞在淋巴濾泡形成中發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示了先天性巨結(jié)腸疾病與并發(fā)癥小腸結(jié)腸炎的潛在聯(lián)系——這種并發(fā)癥是由神經(jīng)節(jié)腸切除后復(fù)雜的神經(jīng) - 免疫相互作用引起的。由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)足以描述在時(shí)間進(jìn)程上致病基因的變化（圖 8D），實(shí)驗(yàn)人員還強(qiáng)調(diào)了 HMGA2 基因與腸道扭轉(zhuǎn)不良有關(guān)。同樣，早期抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性 NXN 的致病性變異（圖 8Eii) 可導(dǎo)致臍膨出。到該發(fā)育進(jìn)程時(shí)，腸道回到了腹部，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了腸神經(jīng)細(xì)胞和肌肉祖細(xì)胞在這個(gè)過程中可能是至關(guān)重要的。

圖 8   子宮內(nèi)基因表達(dá)譜在發(fā)育性疾病中的應(yīng)用

總結(jié)

參考文獻(xiàn)：

[1].Fawkner-Corbett D, Antanaviciute A, Parikh K, Jagielowicz M, Gerós AS, Gupta T, Ashley N, Khamis D, Fowler D, Morrissey E, Cunningham C, Johnson PRV, Koohy H, Simmons A. Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution. Cell. 2021 Feb 4;184(3):810-826.e23. doi: 10.1016/j.cell.2020.12.016. Epub 2021 Jan 5. PMID: 33406409; PMCID: PMC7864098.