人類腸道發(fā)育是一個需要多種細(xì)胞類型相互協(xié)同的高度復(fù)雜的過程。早期發(fā)育中環(huán)境引發(fā)的改變與多種免疫介導(dǎo)的病理學(xué)有關(guān)，包括炎癥性腸病（IBD）。過往研究報道了早期胎兒腸上皮細(xì)胞動力學(xué)與 IBD 之間的聯(lián)系，提示 IBD 患者的腸上皮中可能重現(xiàn)了類似于胎兒的轉(zhuǎn)錄程序。因此，解讀腸道發(fā)育是預(yù)防和治療此類疾病的關(guān)鍵一步。

位于成人腸隱窩底部的干細(xì)胞（LGR5+），分化形成不同的腸道上皮細(xì)胞。在 8 -10  個孕周（PCW）時，胎兒腸道上皮細(xì)胞就具備了形成自組織的腸上皮類器官的能力，說明此時胎兒腸道已經(jīng)存在著 LGR5+ 干細(xì)胞。然而，人類上皮細(xì)胞亞群和其它粘膜細(xì)胞類型之間的相互作用，以及腸絨毛的形成和上皮細(xì)胞的動力學(xué)還未有詳細(xì)的研究。

近日，來自威康桑格研究所及劍橋大學(xué)干細(xì)胞研究所等單位的聯(lián)合研究團隊在 Developmental Cell 期刊發(fā)表了題為“Single-cell sequencing of developing human gut reveals transcriptional links to childhood crohn’s disease”的文章。該研究對不同發(fā)育階段（胚胎，胎兒和兒童）的人類腸道進行單細(xì)胞測序，揭示了與疾病相關(guān)的胎兒腸道上皮細(xì)胞的組成及其分化狀態(tài)。

▲文章發(fā)表于 Developmental Cell 期刊

研究者首先對 6~10 PCW 的人胚胎進行解剖處理，對 4 至 12 歲的健康兒童的小腸進行粘膜活檢，將組織樣本分離成單細(xì)胞懸浮液，使用 10x Genomics 進行單細(xì)胞測序分析。通過對上皮細(xì)胞黏附分子（EPCAM）進行磁珠分選來富集腸上皮細(xì)胞。該研究共分析了 62,854 個胎兒細(xì)胞和 11,302 個兒童回腸末端細(xì)胞。結(jié)果顯示，三個發(fā)育階段（胚胎、胎兒和兒童）均包含七種主要細(xì)胞類型，但在細(xì)胞組成上卻有顯著差異，如：在胚胎及胎兒樣本中，間充質(zhì)細(xì)胞所占比例和多樣性更為豐富；而在兒童樣本中則以免疫細(xì)胞為主，且在發(fā)育中的腸道近端比遠(yuǎn)端更常觀察到分化的細(xì)胞狀態(tài)。此外，單個細(xì)胞簇的時空分布表明，胚胎 / 胎兒上皮細(xì)胞簇根據(jù)腸道區(qū)域和發(fā)育時間點顯著分離，而健康兒童樣本中該現(xiàn)象并不明顯，這些差異突出顯示了在捕獲的時間段內(nèi)腸上皮的主要發(fā)育變化（圖 1）。

圖 1.  胚胎、胎兒和兒童腸道的單細(xì)胞圖譜分析，來源：Developmental Cell

為進一步闡明腸上皮主要發(fā)育變化潛在的機制和途徑，研究者探究了腸絨毛形成過程中腸上皮細(xì)胞類型的變化。首先基于 EPCAM 的表達對胎兒小腸上皮細(xì)胞進行聚類分析，鑒定了 11 個類別及其差異表達基因，包括典型的成體干細(xì)胞基因高表達類（包含 LGR5，ASCL2 等）和均一祖細(xì)胞類（包含 SHH，PLA2G2A，BEX5 等）。結(jié)果顯示 10 PCW 時，均一祖細(xì)胞數(shù)量減少，這與絨毛的出現(xiàn)及 LGR5+ 干細(xì)胞、未成熟和成熟的腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞的出現(xiàn)相一致。接下來研究者使用 BEX5，LGR5 及 MKI67 作為均一祖細(xì)胞的標(biāo)記，來可視化絨毛形成過程中上皮的變化。結(jié)果表明，在胚胎階段，上皮由高度循環(huán)的，表達低水平 LGR5 的均一祖細(xì)胞組成。此外，研究者利用  scVelo 和 PAGA 軌跡算法研究小腸上皮細(xì)胞從胚胎（6-8 PCW）到早期胎兒（9-10 PCW）的細(xì)胞分化動力學(xué)，結(jié)果表明循環(huán)上皮經(jīng)歷了從均一上皮到 LGR5+ 干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變。

圖  2.  人絨毛形成過程中的上皮細(xì)胞組成，來源：Developmental Cell

隨后，研究者繼續(xù)探究了與人類絨毛形成有關(guān)的機制和信號通路。首先定義了小腸和大腸在不同發(fā)育時間點間充質(zhì)細(xì)胞豐度的變化，以鑒定在絨毛形成過程中出現(xiàn)或受限制的潛在細(xì)胞類型。在取樣時間點，可觀察到間充質(zhì)間室發(fā)生重構(gòu)，且在小腸區(qū)域檢測到 FOXL1+ 成纖維細(xì)胞；在 6  PCW 人胚胎中觀察到高表達 PDGFRA 和 FOXL1 / F3 的間充質(zhì)細(xì)胞簇，在 10 PCW 時接近形成的絨毛。之后，利用人類 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，分析確定中胚層細(xì)胞、FOXL1+ 成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是 hedgehog（HH）信號的主要應(yīng)答細(xì)胞，并進一步確定 FOXL1+ 成纖維細(xì)胞與均一祖細(xì)胞之間的特異性相互作用是通過 BMP、PDGF、Notch、Wnt 和 FGF 信號通路實現(xiàn)的（圖 3）。

  圖 3.  從人類胚胎上皮向胎兒上皮轉(zhuǎn)變的細(xì)胞間相互作用，來源：Developmental Cell

腸上皮干細(xì)胞能夠產(chǎn)生各類細(xì)胞亞群，這種特性促進了腸類器官培養(yǎng)模型的發(fā)展，這些類器官可以由人類胎兒的腸道細(xì)胞產(chǎn)生，為研究上皮細(xì)胞內(nèi)在和外在的發(fā)育機制提供了機會。研究者利用 scRNA-seq 技術(shù)對正在發(fā)育的人類腸道類器官進行檢測分析，并使用來自原始組織的轉(zhuǎn)錄圖譜對上皮細(xì)胞進行分類。結(jié)果顯示發(fā)育中的腸道中沒有檢測到 Paneth 細(xì)胞和任何表達 Wnt3a 的間充質(zhì)細(xì)胞。之后，在有無 WNT3a 條件培養(yǎng)基的情況下培養(yǎng)腸上皮器官（IEO），結(jié)果顯示，在 WNT3A 存在下培養(yǎng)的類器官含有更多的分化細(xì)胞類型，包括腸上皮細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞。此外，研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)物中保存了數(shù)月的類器官含有增加比例的分化細(xì)胞亞群以及數(shù)量增加的 LGR5 + 細(xì)胞，這表明當(dāng)前的腸道培養(yǎng)條件選擇了高度增殖的細(xì)胞（圖 4）。

圖 4.  胎兒腸道類器官培養(yǎng)，來源：Developmental Cell

研究者對克羅恩?。–D）兒童患者進行 scRNA-seq 末端回腸活檢，探究腸上皮成分、功能和細(xì)胞動力學(xué)變化對 CD 發(fā)病機制的影響。結(jié)果顯示，CD 與對照樣本的上皮細(xì)胞組成有顯著差異，其中轉(zhuǎn)運擴增細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和簇狀細(xì)胞顯著增加，且 CD 上皮中完全分化的腸細(xì)胞比例顯著降低。研究人員同時鑒定出了大量 CD 不同細(xì)胞類型之間特異性的相互作用。與健康兒童相比，CD 患者杯狀細(xì)胞和 S4 成纖維細(xì)胞的 TNFSF10-TNFRSF10B 信號的特異性降低，而腸上皮細(xì)胞的特異性保持不變。研究者確定了 CD 和發(fā)育中的上皮細(xì)胞之間共有的轉(zhuǎn)錄因子，為 CD 上皮細(xì)胞中發(fā)育性轉(zhuǎn)錄通路的部分重新激活提供了支持性證據(jù)。

圖 5.  來人腦或人腦器官的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)及每個基因模塊內(nèi)基因表達，來源：Developmental Cell

綜上所述，該研究提供了人類胚胎、胎兒和兒童健康腸道以及炎癥性腸道疾病的單細(xì)胞圖譜，剖析了腸道生命過程中上皮細(xì)胞動態(tài)的轉(zhuǎn)錄變化。研究同時將數(shù)據(jù)整理發(fā)布在 http://www.gutcellatlas.org/，提供了交互式探索數(shù)據(jù)的資源。

參考文獻：

Elmentaite R, Ross ADB, Roberts K, et al. Single-Cell Sequencing of Developing Human Gut Reveals Transcriptional Links to Childhood Crohn's Disease. Dev Cell. 2020 Dec 1. DOI: 10.1016/j.devcel.2020.11.010. 

轉(zhuǎn)載：測序中國（侵刪）

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