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實(shí)驗(yàn)技術(shù)：WES+16S rDNA 測序 + 甲基化芯片

期刊：PNAS        

時(shí)間：2019.12.26

研究路線

主要結(jié)果

FMT 移植小鼠：結(jié)腸組織中與生物異常相關(guān)的組織學(xué)改變

FMT 后，N- μ 組表現(xiàn)正常。而 CRC- μ 或 AOM 單獨(dú)處理，以及 CRC-μ+AOM 處理組都表現(xiàn)出了輕微的炎癥反應(yīng)，以及異常隱窩病灶。通過 mRNA 細(xì)胞因子定量評估，AOM 治療傾向于放大這種刺激作用。此外，對整個(gè)組織學(xué)檢查腸粘膜髓細(xì)胞的半定量評估顯示，與 N - μ 相比，CRC- μ 的粘膜髓細(xì)胞數(shù)量有增加的趨勢，但在任何時(shí)間點(diǎn)都沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 A -G: 組織病理學(xué)變化；圖 H: 對細(xì)胞增殖，病理癌變的的影響；圖 I:ACF 的數(shù)量；圖 J：粘膜炎癥變化；圖 K: 腸粘膜髓細(xì)胞的變化。

小鼠體內(nèi) FMT 后的微生物區(qū)系特征變化

為了評估微生物群落對觀察到的粘膜表型差異的影響，對小鼠糞便樣本進(jìn)行 16S rDNA 測序分析，結(jié)果顯示，在基線水平下，與 N - μ 組相比，CRC-μ(n = 9 個(gè)供體）組的糞便微生物群中梭桿菌、帕維單胞菌、丁酸弧菌、和低比例的 Ruminococcus，雙歧桿菌、真細(xì)菌和 Lachnospira。隨訪期間，各組的 Coccoides, Clostridium leptum,  和  Bifidobacterium 均出現(xiàn)中度下降。此外還發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)改變與起到抗炎作用的細(xì)菌含量減少相關(guān)（Faecalibaterium，Eubacterium  以及厚壁菌門的種屬）。

FMT 對小鼠 DNA 突變的影響

為了分析 FMT 對宿主進(jìn)行 DNA 修飾的影響，研究人員對小鼠結(jié)腸黏膜組織進(jìn)行全基因組測序，覆蓋 24000 個(gè)基因中的 220,000 個(gè)外顯子。小腸組織中整體外顯子 / 內(nèi)含子水平的突變發(fā)生率明顯高于脾臟組織。在結(jié)腸黏膜中，N- μ 組在外顯子或內(nèi)含子的 DNA 發(fā)生改變要比 CRC- μ 組低，但并沒有達(dá)到顯著性。此外，給予 CRC-μ+AOM 組的小鼠顯示出高水平的外顯子或內(nèi)含子的 DNA 改變。為了分析 CRC- μ 誘發(fā)的局部致癌潛力，作者繼續(xù)對以下選擇的基因通路進(jìn)行了深入分析：Wnt 和 catenin(19 個(gè)）、Notch(4 個(gè)）、PPAR(3 個(gè)）、SMAD(2 個(gè)）、TGF- inhibitor 2 個(gè)基因，ACRV 2 個(gè)基因，DKK 4 個(gè)基因，TCF 2 個(gè)基因，MYC 1 個(gè)基因，SOCS 1 個(gè)基因。顯著的變化發(fā)生在關(guān)鍵的 Wnt 通路基因中（11 個(gè) Wnt 基因中存在 indel 和單核苷酸多態(tài)性），CRC- μ 組和 N - μ 組之間沒有顯著差異。根據(jù)結(jié)腸粘膜或脾臟樣本中單核苷酸的總 DNA 變化，對動物進(jìn)行亞群分析，表明基因突變與微生物類型（N 或 CRC) 或給小鼠的治療（生理鹽水或 AOM) 有關(guān)。

圖 A：CRC 糞便處理組比對照組，在 exon 和 intron 上的 SNP 位點(diǎn)要多，但是不顯著；圖 B：基于 SNP 的 PCA；圖 D：不同組間 Wnt 基因突變率比較，AOM +CRC- μ 組高

FMT 對小鼠 DNA 甲基化的影響

在小鼠結(jié)腸粘膜組織，CRC- μ 相對于 N - μ 可以誘發(fā)更大的表觀遺傳改變。N-μ + NaCl  甲基化高于 CRC-μ + NaCl  高于 CRC-μ + AOM  組；CRC-μ + AOM  組的為甲基化探針數(shù)比 N -μ + NaCl   組高 11%，CRC-μ  和 AOM  處理后，完全甲基化的探針較高。

結(jié)腸癌病人樣本中的基因甲基化

通過檢測血液，糞便，CRC 組織和排泄物（n = 9) 和正常組排泄物（n = 9) 的甲基化，從高甲基化的基因上，選出 8 個(gè)在所有樣本中都一致的基因（Wif1-regulating gene and SEPT9, SFRP1,2,3,PENK, NPY, and ALX4 genes），確定了 3 個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。三個(gè)基因和一個(gè)看家基因的 CMI 值可以區(qū)分 CRC 和正常人，specificity and the sensitivity of CMI > 2 in blood was 95 and 59%。多因素分析顯示 CMI 是 CRC 診斷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，包括糞便免疫化學(xué)血液檢測。

微生物組成與 CMI 的關(guān)系

根據(jù)基因的 CMI 值可以把群體分成兩類，CMI 大于 2 和 CMI≤2。宏基因組分析顯示，在 CMI > 2 患者（n = 53) 和 CMI≤2（n = 90) 患者中，包括幾種 Parvimonas(單胞菌）在內(nèi)的 20 種細(xì)菌在豐度上存在差異。

結(jié)論

CRC 相關(guān)的微生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致宿主基因甲基化，相應(yīng)的 CMIs 和相關(guān)細(xì)菌可能是 CRC 的 biomarkers。

參考文獻(xiàn)：Colorectal cancer-associated microbiota contributes to oncogenic epigenetic signatures. Sobhani et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2019)